图 1 pH值对分离的影响
Fig.1 Effect of pH values on separation
表 1 校准曲线、线性范围和检出限
Table 1 Calibration curve, linear range and LOD PAEs
HUANG Qi,JI Xiaojuan,XU Lifeng.Detection of phthalate acid esters in rice wine by microemulsion capillary electrokinetic chromatography[J].Journal of Zhejiang University of Science and Technology,2018,31(03):187-192.[doi: 10.3969/j.issn.1671-8798.2018.03.002]
[PDF全文]
建立了微乳毛细管电动色谱法分离检测12种邻苯二甲酸酯类(PAEs)增塑剂的方法。考察了缓冲液类型及质量浓度、pH、表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)质量浓度、助表面活性剂质量浓度、乙腈体积分数等对12种PAEs分离的影响。结果 表明,最佳的微乳液组成为:质量浓度为33.1 mg/mL的SDS、66.1 mg/mL的正丁醇、8.1 mg/mL的正辛烷,体积分数为12%的乙腈、77.3%的6 mmol/L磷酸盐-硼砂缓冲液(pH值为9.0)。当分离温度为20 ℃,分离电压为20 kV,检测波长230 nm时,12种PAEs在20 min内达到基线分离。12种PAEs的平均回收率和精密度分别为85.3%～96.9%和3.4%～6.8%,方法检出限(S/N=3)低至0.5 μg/mL。该方法操作简便,灵敏度较高,试验结果准确可靠,可用于黄酒样品中12种PAEs的检测,结果满意。
A microemulsion electrokinetic chromatographic(MEEKC)method was developed to separate and detect 12 phthalate acid esters(PAEs)in rice wine. A variety of factors were examined, including pH values, and mass concentration of buffer solution, sodium dodecyl sulfate(SDS)surfactant, co-surfactant, volume fraction of acetonitrile, in order to optimize their effects on the separations of 12 PAEs. The results indicated that an optimal MEEKC separation method was achieved by using a microemulsion solution of pH 9.0 containing 33.1 mg/mL(w/v)SDS, 66.1 mg/mL(w/v)1-butanol, 8.1 mg/mL(w/v)octane, 12%(v/v)acetonitrile and 77.3%(v/v)6 mmol/L phosphate-borax buffer solution. The 12 PAEs were baseline separated within 20 min at 20 kV and 20 ℃, when the detection wavelength being 230 nm. Under the optimized experimental conditions, the average recoveries and precision rates of 12 PAEs were in the ranges of 85.3%～96.9% and 3.4%～6.8%, respectively. The lowest limit of detection(LOD)was 0.5(μg/mL). The MEEKC method, simple in operation, high in sensitivity and reliable in result, has been successfully applied for the analysis of 12 PAEs in rice wine with satisfactory results.
邻苯二甲酸酯类(phthalate acid esters,PAEs)增塑剂广泛应用于塑料工业,普遍存在于食品包装材料、玩具、医用血袋和胶管、个人护理用品等数百种产品中,对人体的健康有严重的危害。研究表明,PAEs又是一类环境激素,有类似雌性激素的作用,长期接触可干扰内分泌,尤其对于男性,可造成生殖问题[1-3]。PAEs比较容易迁移到环境中,可通过食品包装材料迁移到食品中而被人体吸收。近年来,对于邻苯二甲酸酯类产生的危害时有报道[4],欧盟、美国、中国等国家和地区都制定了限制PAEs使用的法律法规。
黄酒是中国古老传统酒种之一,浙江省黄酒尤其是绍兴黄酒在国内外久负盛名。近年来,黄酒中邻苯二甲酸酯类增塑剂超标问题日益引起关注。黄酒中乙醇含量较高,而乙醇对PAEs有良好的溶解能力,在黄酒与塑料制品如塑料容器、塑料内盖、塑料接酒桶等的接触过程中PAEs有迁移到黄酒中的风险。黄酒中PAEs的测定方法大多采用GC-MS法[5-8]、HPLC法[9-10]、UPLC法[11-12]等,这些方法对仪器要求比较高,而采用微乳毛细管电动色谱法(MEEKC)测定黄酒中PAEs鲜有报道。因此,本研究在经典微乳体系基础上加入有机添加剂乙腈,可分离并同时测定12种邻苯二甲酸酯类增塑剂,将其应用于黄酒中PAEs的检查。
1 试验部分1.1 仪器与试剂仪器:SQ-Agilent 7100高效毛细管电泳仪(美国Agilent公司); 未涂层熔融石英毛细管:65.2 cm×75 μm,有效长度57.5 cm(河北永年锐沣色谱器件有限公司); Oasis HLB Glass柱(6 mL/200 mg,美国Waters公司); 旋转蒸发器(上海予捷仪器有限公司)。
试剂:邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯(DMEP)、邻苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯(DEEP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二烯丙酯(DAP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)、邻苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯(DBEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)、邻苯二甲酸二己酯(DHXP)标准品,德国Dr.Ehrenstorfer公司,纯度均大于96%; SDS(纯度>98%),美国Sigma公司; 正己烷(色谱纯),美国Sigma公司。试验用水为三次重蒸水; 试验过程避免接触塑料容器; 黄酒样品购自本地超市。
1.2 溶液的制备1.2.1 微乳液的制备缓冲溶液pH值用1 mol/L NaOH和1 mol/L H3PO4溶液调节。取SDS、正丁醇、有机添加剂和油相溶于缓冲液,超声混合30 min。
1.2.2 标准溶液准确量取12种邻苯二甲酸酯标准溶液,用微乳缓冲溶液超声溶解,定容至100 mL,低温保存。
1.2.3 样品的提取、净化参考文献[12],准确称取5.00 g黄酒样品置25 mL烧杯中,加水稀释,使乙醇体积分数小于5%。将稀释液加入活化后的Oasis HLB Glass柱,控制流速1 mL/min,用5 mL 5%甲醇水溶液淋洗,待淋洗液流干,用5 mL乙酸乙酯洗脱,收集洗脱液,氮气吹干,超声溶解于微乳缓冲溶液,定容至1.0 mL,经0.45 μm滤膜过滤,待进样分析。
1.3 试验方法试验前分别用0.5 mol/L NaOH、水和缓冲溶液冲洗毛细管5 min,2次运行之间按上述条件重复冲洗。分离电压20 kV,进样时间6 s,进样压力5.0 kPa,温度20 ℃,检测波长230 nm。
2 结果与讨论2.1 微乳体系的组成MEEKC中经典的微乳体系由质量浓度为33.1 mg/mL的SDS、66.1 mg/mL的正丁醇、8.1 mg/mL的正辛烷和体积分数为89.3%的10 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值为8.5)组成[13]。pH值会影响分离度,有机添加剂能明显改善分离选择性,而SDS浓度和水相电解质浓度会对分离时间产生影响[14]。在12种邻苯二甲酸酯类增塑剂中,DIBP、BBP、DBEP和DBP 4种增塑剂较难分离。
图1 pH值对分离的影响
Fig.1 Effect of pH values on separation
因此,本试验以经典微乳体系作为研究起点,对影响结构相近物分离的因素进行优化,使12种邻苯二甲酸酯类增塑剂得以分离。
2.1.1 缓冲液体积分数在2～10 mmol/L范围内,随着磷酸盐体积分数的增加,12种PAEs的分离度有所改善,工作电流有所增大,但迁移时间没有明显变化。为减少工作电流,选择6 mmol/L的磷酸盐-硼砂缓冲液。
2.1.2 pH值pH值对12种PAEs分离度的影响见图1。由图1可知,12种PAEs的迁移时间随着pH值的增大而有所增加,相邻PAEs的分离度有所改善。在pH值为9.0时,12种PAEs均能获得较好峰形和适宜的分离时间。综合考虑分离度、灵敏度和适宜的出峰时间,选择pH值为9.0。
2.1.3 SDS质量浓度
图2 乙腈体积分数对4种PAEs分离的影响
Fig.2 Effect of acetonitrile volume fraction on separation of 4 PAEsSDS
对形成稳定均一的微乳液是非常重要的,并可影响分离的效果。当SDS质量浓度过高时,电泳的电流会产生较大的焦耳热,工作电流也随之增加; 当SDS质量浓度降到20 mg/mL时,微乳液会变浑浊,导致分离体系不稳定。结合分析时间和分离效率,仍采用质量浓度为33.1 mg/mL的SDS。
2.1.4 有机添加剂的影响体积分数为20%以内的乙腈和甲醇常作为MEEKC的有机添加剂[14]。有机添加剂可以改变被分析物在油相和水相的分配系数,增加时间窗口、改善峰形、提高柱效。对较难分离的DIBP、BBP、DBEP和DBP,添加乙腈后可明显改善分离度。由图2可知,不同乙腈体积分数(4%、8%、12%、16%)对4种PAEs的分离有明显改善,综合考虑出峰时间和分离度,本试验选择添加体积分数为12%的乙腈。
2.1.5 电泳条件电压在15～30 kV范围内,随着电压的升高,12种PAEs的迁移时间会减少,高电压会引起焦耳热问题,因此,选择分离电压20 kV。当分离温度为20 ℃时,能获得较好的重现性。
2.1.6 MEEKC分离条件通过对各因素的考察,最终确定的微乳体系为:质量浓度为33.1 mg/mL的SDS、66.1 mg/mL的正丁醇、8.1 mg/mL的正辛烷,体积分数为12%的乙腈、77.3%的6 mmol/L磷酸盐-硼砂缓冲液(pH值为9.0)。分离电压20 kV,分离温度20 ℃,检测波长230 nm。在该色谱条件下,12种PAEs标准混合液微乳毛细管电动色谱分离谱图见图3,较难分离的DIBP、BBP、DBEP和DBP达到基线分离。空白黄酒样品在12种PAEs的出峰时间范围内无干扰,检出PAEs的黄酒样品谱图见图4。
图3 12种PAEs标准混合液的分离谱图
Fig.3 Electropherogram of 12 PAEs by MEEKC
图4 检出PAEs的黄酒样品的微乳电动色谱分离谱图
Fig.4 Electropherogram of PAEs in rice wine sample by MEEKC
2.2 样品的提取、净化
黄酒中乙醇含量较高,对PAEs的溶解性较好,需要先降低样品中酒精含量,清除基质中的氨基酸等干扰物。本研究采用文献[12]的固相提取方法对黄酒样品提取、净化,检测时样品对12种PAEs无干扰。
2.3 线性范围和检出限采用外标定量法,得到12种PAEs的线性回归方程和检出限(LOD,S/N=3),结果见表1。GB 9685—2008《食品容器、包装材料用添加剂使用标准》规定食品容器、包装材料的添加剂中,DBP迁移到食品中的最大量不得超过0.3 mg/kg,DEHP迁移到食品中的最大量不得超过1.5 mg/kg[15],分别相当于1.5 μg/mL和7.5 μg/mL,高于该方法的检出限,因此该方法满足我国卫生部对食品、食品添加剂中PAEs的最大残留量检测要求。
表1 校准曲线、线性范围和检出限
Table 1 Calibration curve, linear range and LOD PAEs
2.4 重现性
PAEs混合标准溶液(100 μg/mL)的日内和日间精密度测定结果见表2,12种PAEs的迁移时间和峰面积重现性良好。
表2 方法重现性(n=6)
Table 2 Reproducibility(n=6)%
2.5 加标回收率试验
对不含PAEs的黄酒样品,测定其分别在10、200 μg/mL的添标水平下的加标回收率,结果见表3。
表3 方法回收率和精密度(n=6)
Table 3 Recovery and precision rates(n=6)%
2.6 样品的检测
对市场上10种黄酒品牌(每种品牌6批)测定,有1个品牌样品检出DMP、DEP、DIBP、DBP和DEHP 5种PAEs,有1个品牌样品检出DMP、DBP和DEHP等3种PAEs,有2个品牌样品检出DIBP和DEHP等2种PAEs,其余品牌中未检出PAEs。
3 结 论本研究在常用微乳毛细管电动色谱的微乳体系中添加乙腈,可使2种PAEs达到基线分离。试验所用仪器易于普及,试验所用试剂环境友好。本研究所建立的MEEKC方法能检测黄酒中的12种PAEs,方法检测限低至0.5 μg/mL,精密度和准确度良好,能满足黄酒样品中常见PAEs的限量检测要求。
- [1] SONNENSCHEIN C,SOTO A M.An updated review of environmental estrogen and androgen mimics and antagonists[J].The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 1998,65(16):143.
- [2] 刘慧杰.邻苯二甲酸酯类化合物的毒理学效应及对人群健康的危害[J].第三军医大学学报,2004,26(19):1778.
- [3] 张景,王竹天,樊永祥,等.邻苯二甲酸酯类的毒性、分析方法及使用规定[J].中国食品卫生杂志,2012,24(5):504.
- [4] 樊继彩,黄希汇,任韧,等.杭州地区食品中20种邻苯二甲酸酯的污染调查[J].中国卫生检验杂志,2014,24(10):1474.
- [5] 荣维广,阮华,马永建,等.气相色谱-质谱法检测白酒和黄酒中18种邻苯二甲酸酯类增塑剂[J].分析试验室,2013,32(9):40.
- [6] 吴鹏,於香湘,缪建军.小体积液液萃取气相色谱-质谱法测定水体中邻苯二甲酸酯[J].分析科学学报,2013,29(1):139.
- [7] 盛建华,祝建华,张卉,等.气相色谱-串联质谱法同时测定食品中18种邻苯二甲酸酯[J].分析科学学报,2012,28(6):855.
- [8] 郑向华,林立毅,方恩华,等.固相萃取-气相色谱-质谱法测定食品中23种邻苯二甲酸酯[J].色谱,2012(1):27.
- [9] 马燕玲,陈令新.超声辅助分散液液微萃取-高效液相色谱测定水样中的4种邻苯二甲酸酯类增塑剂[J].色谱,2013,31(2):155.
- [10] 佟晓波,李莹,娇筱曼,等.HPLC法测定化妆品中十六种邻苯二甲酸酯类化合物[J].香精香料化妆品,2012(6):33.
- [11] 和佳鸳,蒲彦利,闻向梅,等.超高效液相色谱-串联质谱法测定醋和黄酒中邻苯二甲酸酯类塑化剂[J].中国卫生检验杂志,2015,25(18):3063.
- [12] 吴敏,郑向华,张志刚,等.前吸附技术-超高压液相色谱-串联质谱法同时测定酒中24种邻苯二甲酸酯[J].分析试验室,2016,34(7):673.
- [13] HUANG H Y, CHUANG C L, CHIU C W, et a1. Determination of food colorants by microemulsion electrokinetic chromatography[J]. Electrophoresis,2005,26(4/5):867.
- [14] 彭振磊,林金明.毛细管微乳电动色谱应用的研究进展[J].色谱,2009,27(5):621.
- [15] 中国国家标准化管理委员会.食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准:GB 9685—2008[S].北京:中国标准出版社,2008:12-13.