干酪是乳类在凝乳酶或其他凝乳剂的作用下凝固后排放乳清而得到的固态或半固态食品^[1],它的种类众多,工艺不尽相同,其加工过程中常有微生物参与将糖类转化成有机酸或由凝乳酶作用使蛋白质凝固^[2]。干酪含有丰富的蛋白质,在成熟过程中在微生物分泌的蛋白酶等作用下,产生大量的氨基酸,一方面形成干酪特有的风味和品质^[3-4],另一方面微生物产生的酶也会对游离氨基酸产生脱羧基作用而生成生物胺^[5]。盐的含量^[6]、pH^[7]、成熟温度和时间^[8]等会影响生物胺的形成。干酪中常见的生物胺有色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺和亚精胺等^[9-11]。生物胺的活性与生物胺的含量关系较大,少量的生物胺具有多种生理活性^[12-14],但摄入过量的外源性生物胺时,有可能产生心悸、头痛、血压变化等不良症状^[15]。

国内外对生物胺的检测方法有高分辨质谱法^[16]、液相色谱-质谱法^[17-18]、液相色谱法^[19-20]、离子色谱法^[21]、气相色谱-质谱法^[22]等,在这些方法中,高效液相色谱法是最稳定、最常用的方法之一。Vieira等^[20]采用0.6 mol/L的高氯酸溶液振荡提取了酸奶中的生物胺,建立了反向高效液相色谱检测酸奶中生物胺的检测方法。刘继超等^[23]采用三氯乙酸溶液振荡提取60 min,连续提取两次,高效液相色谱法测定了乳制品中的生物胺,生物胺的总量范围为10.30～34.00 mg/kg。刘蕾等^[9]将干酪样品用0.1 mol/L的盐酸溶液匀浆提取30 min,重复两次,且经过pH调整、正丁醇-三氯甲烷溶液反复提取和盐析等净化程序,采用高效液相色谱法分析了传统干酪中的8种生物胺含量。当前,乳制品中生物胺的提取方法多采用振荡提取或匀浆提取方式,并经过有机溶剂反复提取、盐析等复杂的净化过程再衍生化处理,前处理时间较长,操作繁琐。干酪在加工成熟过程中易形成生物胺且基质复杂,有必要进一步研究适合干酪中生物胺的提取溶剂、提取方式和快速检测方法。

本研究建立了超声波辅助提取-高效液相色谱法同时检测干酪中9种生物胺的测定方法,优化生物胺提取溶剂和超声波提取条件,可以提高样品的提取效率,同时简化样品净化过程,缩短前处理时间; 并将其应用于市售干酪样品的测定分析。

标准品:2-苯乙胺(Phenylethylamine,Phe)、腐胺(Putrescine,Put)、尸胺(Cadaverine,Cad)、组胺(Histamine,His)、酪胺(Tyramine,Tyr)和亚精胺(Spermidine,Spd),纯度均大于99%,北京曼哈格生物科技有限公司; 章鱼胺(Octopamine,Oct)、色胺(Tryptamine,Try)和精胺(Spermine,Spm),纯度均大于98%,北京曼哈格生物科技有限公司; 丹磺酰氯(Dansyl chloride),上海安谱实验科技股份有限公司。

试剂:乙腈、正己烷,均为色谱纯,德国Merck公司; 盐酸、三氯乙酸、乙醚、丙酮、乙酸、乙酸铵、氢氧化钠,均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

沃特世Acquity Arc高效液相色谱仪,紫外检测器2998,美国沃特世公司; FA2004电子天平,上海舜宇恒平科学仪器; Milli-Q超纯水仪,美国密理博公司; VORTEX2旋涡混合器,德国艾卡公司; 2-16P离心机,德国西格玛公司; DS-8510DTH超声波清洗器,上海生析超声仪器有限公司。

采用沃特世C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)分离,紫外检测波长254 nm,流动相A为10%乙酸铵(0.01 mol/L,含1%乙酸)/90%乙腈,B为90%乙酸铵(0.01 mol/L,含1%乙酸)/10%乙腈; 进样量为20.0 μL; 柱温为35 ℃; 流速为0.8 mL/min。流动相洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution program of mobile phase

标准储备液的配制:以0.1 mol/L的盐酸溶液为溶剂配制质量浓度为1 mg/mL的单标储备液。

混合标准使用液的配制:准确吸取单标储备液1.0 mL至同一10 mL容量瓶中,用0.1 mol/L的盐酸溶液定容,配制成质量浓度为100 mg/L的混合标准溶液,冰箱4 ℃保存。

标准系列溶液的配制:吸取混合标准溶液,以0.1 mol/L的盐酸配制成0.5～50.0 mg/L系列标准工作液。

丹磺酰氯衍生化溶液配制:准确称取丹磺酰氯,以丙酮为溶剂配制成质量浓度为10 mg/L的标准使用液,冰箱4 ℃保存。

分别吸取1 mL生物胺系列标准溶液于10 mL具塞试管中,依次加入饱和碳酸氢钠1 mL,氢氧化钠溶液(1 mol/L)100 μL,衍生化试剂1 mL,涡旋振荡,恒温箱中60 ℃反应15 min后取出。加入谷氨酸钠100 μL,60 ℃继续反应15 min后取出,加入1 mL纯水混匀,40 ℃氮吹除去丙酮,5 mL乙醚涡旋提取,吸出上层乙醚层,再提取一次,合并提取液,40 ℃氮吹仪吹干,1 mL乙腈溶解,0.22 μm滤膜过滤后待测。

以干酪样品作为基质添加混合标准溶液,分别采用0.1 mol/L的盐酸溶液、质量分数为5%三氯乙酸溶液作为提取溶剂,超声波提取30 min,进行提取溶剂选择。

以干酪样品为基质添加混合标准溶液,在功率为500 W、温度为30 ℃时分别超声5、10、15、30 min,进行超声时间选择研究; 选择合适的超声时间,40 ℃超声波提取,进行超声温度选择。

将适量干酪样品研磨均匀,准确称取5 g于50 mL具塞离心管中,加入12.5 mL质量分数为5%的三氯乙酸溶液涡旋振荡2 min,30 ℃超声波提取15 min,8 000 r/min离心5 min,转移上清液至另一离心管中,连续提取两次,合并上清液,滤纸过滤。移取上述滤液5 mL于15 mL离心管中,加入等体积正己烷,涡旋振荡2 min; 静置分层,弃去上层正己烷层,下层样液待衍生。

取待衍生试液1 mL,按照1.3.3节中衍生化步骤进行衍生。

在干酪样品基质中分别添加低、中、高三个不同水平的混标溶液,按照1.3.6节方法提取,以及1.3.3节的方法衍生; 同时做空白对照试验,考察加标回收率和相对标准偏差。

按照1.3.1节的色谱条件,试剂的空白色谱图见图1,图中显示试剂空白在29 min左右有一个明显的杂质峰。9种生物胺经丹磺酰氯衍生化后色谱峰在35 min内完全分离,如图2所示,出峰顺序依次为色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、章鱼胺、酪胺、亚精胺和精胺,各生物胺质量浓度均为25 mg/L,分离效果较好。

图1 试剂的空白色谱图
Fig.1 Chromatograms of reagent blank

图2 9种生物胺色谱图
Fig.2 Chromatograms of 9 kinds of biogenic amines

食品中生物胺的提取溶剂常用的有盐酸^[9]、三氯乙酸^[23]、高氯酸^[24]等,本试验采用0.1 mol/L的盐酸溶液和质量分数为5%的三氯乙酸溶液提取干酪中的生物胺。结果表明,盐酸溶液和三氯乙酸均可沉淀蛋白质,但是经过超声波处理以后,样品的盐酸提取液变得较为混浊,离心后溶液仍然混浊且难以过滤,提取液损失较大; 而三氯乙酸超声波提取液离心后溶液较清,易于过滤。因此,选择质量分数为5%的三氯乙酸溶液作为干酪提取溶剂。

超声波提取是利用超声波形成的能量声场对溶液进行声空化作用来提取目标物质。郭慧^[25]采用功率为50 W的超声波处理生物胺混标60 min,发现超声波对生物胺没有破坏作用。本试验考察了在温度为30 ℃时超声时间对不同生物胺回收率的影响,结果如图3所示。由图3可知,色胺在5～10 min内随着超声时间的延长回收率逐渐升高,超声10 min时回收率最高,之后有所下降; 其余8种生物胺在5～15 min时间内,随着超声时间的延长回收率逐渐增大; 所有生物胺在超声15、30 min时,回收率变化趋于平缓,均达到80%左右及以上。综合考虑,选择15 min的超声时间作为以后生物胺的提取时间。

图3 超声时间对生物胺回收率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic time on recovery rates of biogenic amines

超声温度对提取也会有一定的影响。郭慧^[25]优化了水产品中生物胺的超声波提取条件,超声温度50 ℃、超声时间25 min为最优组合。本试验采用15 min的超声时间,考察了30、40 ℃超声温度对干酪生物胺回收率的影响,结果如图4所示。由图4可知,30 ℃时9种生物胺的回收率在80%～100%之间,40 ℃时回收率较30 ℃时稍有降低。因此,选择回收率较高、处理温度相对温和的30 ℃作为生物胺超声波提取时的温度。

图4 超声温度对生物胺回收率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on recovery rates of biogenic amines

分别配制质量浓度为0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0 mg/L系列标准混合溶液,以标准品峰面积为纵坐标,质量浓度为横坐标,绘制标准曲线。生物胺的线性方程、检出限和定量限见表2。由表2可知,7种生物胺(Try、Phe、Put、Cad、His、Oct、Tyr)在0.25～50 mg/L范围内线性关系良好,线性相关系数均在0.996～0.999之间; 2种生物胺(Spd、Spm)在0.25～25 mg/L范围内线性关系良好,线性相关系数分别为0.993和0.995。9种生物胺检出限为0.38 mg/kg,定量限为1.25 mg/kg。

表2 生物胺的线性方程、检出限和定量限
Table 2 Linear equation, LODs and LOQs of biogenic amines

在干酪基质中分别添加低、中、高三个水平的混合标准溶液,选择优化的条件即质量分数为5%的三氯乙酸溶液提取、超声时间为15 min、超声温度为30 ℃,进行加标回收试验,生物胺的回收率与相对标准偏差见表3。由表3可知,9种生物胺的平均回收率为76.3%～90.1%(n=3),相对标准偏差为1.09%～7.45%(n=3),这说明本研究提出的方法的重复性和精密度良好,适用于干酪中9种生物胺的测定分析。

表3 生物胺的回收率与相对标准偏差
Table 3 Recovery rates and RSD of biogenic amines

将本研究建立的生物胺测定方法用于市售天然干酪样品的检测,干酪样品中生物胺含量测定见表4。由表4可知,7个样品中均检测出不同含量的生物胺,生物胺总含量范围为2.44～78.1 mg/kg,各类生物胺的含量为未检出至55.4 mg/kg,不同样品间生物胺种类和含量均有较大的差异。在这些样品中共检测出7种生物胺,腐胺在所有样品中均被检出,含量范围为1.28～7.51 mg/kg。于华宁等^[26]在市售的6种Camembert干酪中也均测定出了腐胺。5个样品中检出了组胺,含量为1.85～55.4 mg/kg; 4个样品中检出了亚精胺,含量为1.34～2.86 mg/kg; 分别有3个样品中检出尸胺和酪胺,各有1个样品检出苯乙胺和精胺,所有样品均未检出色胺和章鱼胺。所测9种生物胺中,含量最高的为样品2中的组胺55.4 mg/kg,其次为酪胺10.2 mg/kg。干酪中生物胺的产生和含量受微生物、环境因素、贮存时间、干酪种类等多方面因素的影响,其中能够产氨基酸脱羧酶的微生物是最重要的因素,如乳酸链球菌可将组氨酸转化成组胺,瑞士乳杆菌具有形成酪胺的性能等^[27]; 腐胺则主要由于受精氨酸的脱羧和转氨基的作用形成鸟氨酸,鸟氨酸再经脱羧作用形成腐胺^[28],一些发酵剂或非发酵剂的菌株都可能促使腐胺的生成。当前,欧盟推荐食品中组胺含量不得超过100 mg/kg,酪胺不得超过100～800 mg/kg^[29],本试验所测的这几种生物胺含量均远低于推荐限量值。

表4 干酪样品中生物胺含量测定
Table 4 Determination of biogenic amines in cheese samples(mg/kg)

本研究建立了基于超声波辅助提取干酪中9种生物胺的高效液相色谱快速检测方法。生物胺在各自线性范围内线性关系良好,方法回收率高,精密度和重现性好。将本研究提出的方法用于市售干酪样品分析,不同样品间生物胺种类和含量差异较大,需持续关注。本研究提出的方法简化了乳制品中生物胺的提取和净化流程,提高了分析效率,适合干酪中多种生物胺的快速检测,可为深入研究乳制品中生物胺形成机制和安全评价提供技术手段。