银杏叶提取物(ginko biloba extract,GBE)主要含有银杏黄酮(如槲皮素、山奈酚、异鼠李素)、银杏内酯(A、B、C)等活性成分,具有清除自由基、抗氧化、抗炎症、抗细胞凋亡、调节血脂、防治动脉粥样硬化等作用,因此广泛用于防治心脑血管疾病^[1-3]。银杏叶提取物中还含有银杏酸,包括C13:0(R=C₁₃H₂₇)、C15:0(R=C₁₅H₃₁)、C15:1(R=C₁₅H₂₉)、C17:1(R=C₁₇H₃₃)、C17:2(R=C₁₇H₃₁)等,这类化合物具有致敏性、胚胎毒性、细胞毒性、免疫毒性,因此银杏叶提取物必须脱除银杏酸^[4]。德国限定GBE中银杏酸含量应在5 mg/kg以下,中国药典也限定GBE中银杏酸含量应在10 mg/kg以下^[5-7]。

目前已有多种银杏酸脱除方法的报道。通过大孔吸附树脂纯化,能使银杏酸的含量控制在5 ppm以下^[8-9]。吴向阳^[10]等研究了超临界CO₂脱除银杏酸工艺,脱除率为79.1%。除此之外,还有发酵法^[11-12]、中药配伍减毒法^[13]等也可以降低银杏叶产品中的银杏酸含量。为了获得更好的脱除效果,本研究采用有机溶剂萃取法,在保留银杏黄酮和银杏内酯的情况下研究银杏酸脱除工艺。

Waters e2695高效液相色谱仪,配有2424蒸发光散射检测器和2998紫外检测器,Thermo Biofuge Primo R高速冷冻离心机,RE-52旋转蒸发器,SB-5200DT数控超声波清洗机,XMTD-204数显式电热恒温水锅。

原料:5种银杏叶样品于2017年3月购自山东、河南、河北、湖北及云南的中药房,分别命名为YP1、YP2、YP3、YP4、YP5,用中草药粉碎机将银杏叶研磨成粉,干燥储存备用。

标准品:银杏酸标准品(C13:0、C17:1)、银杏内酯标准品(银杏内酯A、B、C)、银杏黄酮标准品(山奈酚标、槲皮素标、异鼠李素标),均购自上海长哲生物科技有限公司。

主要试剂:磷酸、乙醇、磷酸氢二钠、三氟乙酸等为分析纯,甲醇和乙腈为色谱纯,均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

银杏叶提取物按照文献[14]方法制备:银杏叶用中草药粉碎机粉碎,称取70 g粉末于圆底烧瓶中,加入500 mL体积分数为70%的乙醇溶液,回流提取2 h,抽滤,残渣再用500 mL体积分数为70%的乙醇溶液回流提取2 h。合并提取液,静置24 h,上清液旋转蒸发浓缩,浓缩液在-20 ℃冰箱中保存。

配制5份体积分数为60%的乙醇溶液,分别用盐酸溶液调节pH值至2、3、4、5和6。分别量取20 mL正己烷、20 mL不同pH值的乙醇溶液、2 mL银杏提取浓缩液加入分液漏斗,振荡萃取,待静置分层后,将上下相分别蒸干,体积分数为50%的甲醇溶液定容至10 mL,分别用高效液相色谱测定上下相中的银杏酸、银杏内酯和银杏黄酮含量。

在最适pH条件下配制体积分数为0%、20%、40%、60%、80%的乙醇溶液,取20 mL正己烷、20 mL不同体积分数的乙醇溶液、2 mL银杏提取浓缩液加入分液漏斗,萃取、浓缩后定容,分别用高效液相色谱测定上下相中的银杏酸、银杏内酯和银杏黄酮含量。

在最适pH条件和乙醇体积分数下,以正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯分别作为有机相。取20 mL不同有机相,20 mL最适pH和体积分数的乙醇溶液、2 mL银杏提取浓缩液加入分液漏斗,萃取、浓缩后定容,分别用高效液相色谱测定上下相中的银杏酸、银杏内酯和银杏黄酮含量。

本研究所用银杏酸、银杏内酯和银杏黄酮的分析均采用欧洲药典方法^[5]进行。

1.银杏酸分析方法 色谱柱:WelchromC8(4.6 mm×250 mm,5 μm)反向色谱柱色谱柱,检测器为2998紫外光检测器。流速为1 mL/min,流动相A为体积分数0.01%三氟乙酸水溶液,流动相B为体积分数0.01%三氟乙酸乙腈溶液。梯度条件:0～30 min,25% A变化到10% A,维持5 min,1 min内变化到25% A,维持9 min。柱温25 ℃,上样量50 μL,波长210 nm。

2.银杏黄酮分析方法 色谱柱:WondaCract ODS-2(4.6 mm×250 mm,5 μm)反向色谱柱检测器,2998紫外光检测器。流速1 mL/min,流动相A为0.3 g/L磷酸水溶液,流动相B为甲醇。梯度条件:0～1 min,60%A; 1～20 min,A从60%变化到45%; 20～21 min,A从45%变化到0%,维持4 min。柱温25 ℃,上样量10 μL,波长370 nm。

表1 银杏内酯液相分析洗脱梯度
Table 1 Elution gradient of ginkgolidesanalyzed by HPLC

3.银杏内酯分析方法 色谱柱:WondaCract ODS-2(4.6 mm×250 mm,5 μm)反向色谱柱,2424蒸发光散射检测器,流速1 mL/min,流动相A为甲醇,流动相B为水,柱温25 ℃,上样量10 μL,增益500,气体压力40 psi(2.76×10⁵ Pa),动力级别10,漂移管温度70 ℃。梯度条件见表1。

4.分配比计算 上相和下相分别定容到10 mL后,用液相法测定上相和下相中银杏内脂、银杏黄酮和银杏酸的质量浓度(mg/mL)。银杏内酯为银杏内酯A、B和C含量的总和; 银杏黄酮为槲皮素、山奈酚和异鼠李素含量的总和; 银杏酸为银杏酸A和银杏酸B含量的总和。两相的分配比按照下列公式计算:

分配比=水相中各活性成分质量浓度(mg/mL)/有机相中各活性成分质量浓度(mg/mL)。

根据1.2.5分析方法,配制系列浓度的银杏内酯、银杏黄酮和银杏酸标准液,HPLC测定标准曲线,结果见表2。

表2 银杏内酯、银杏黄酮和银杏酸标准曲线
Table 2 Standard curves of ginkgolides, ginkgo flavones and ginkgolic acids

图1 5种银杏叶样品银杏酸含量
Fig.1 Ginkgolic acid contents in 5 species of ginkgo sample leaves

通过HPLC法测定了不同产地银杏酸含量,结果如图1所示,表明银杏叶中总银杏酸含量具有一定的区域性,该结果与文献[15]报道一致。为了研究脱酸效果,本研究采用银杏酸含量最高的产自云南的银杏叶YP5为原料开展研究。经过溶剂萃取、干燥后得到银杏叶提取物,银杏酸含量为1.78 mg/g,其含量远超中国药典要求。

正己烷为有机相,60%乙醇为水相,水相pH值分别为2、3、4、5和6时,银杏叶提取物中各物质的上下相分配比如图2所示。

从图2中可知,水相pH值对银杏叶提取物中各成分的分配比有较大的影响。银杏黄酮几乎不溶于正己烷,全部分配于下相。银杏内酯也主要分配于下相,pH值越低,在下相分配越多。而银杏酸却刚好相反。当pH值为6时,大部分银杏酸也分配在下相,当pH值为2时,分配比最少,表明在此pH值下,银杏酸更多地分配在上相。由此可知,pH值为2时,银杏酸的脱除效果最好。

图2 水相pH值对银杏内酯和银杏酸分配比的影响
Fig.2 Effects of pH value of aqueous phase on partition ratios of ginkgolide and ginkgolic acid

正己烷为有机相,水相pH值为2,乙醇体积分数为0%、20%、40%、60%和80%时,银杏叶提取物中各物质的上下相分配比如图3所示。

图3 水相乙醇体积分数对银杏内酯和银杏酸分配比的影响
Fig.3 Effects of ethanol volume fraction of aqueous phase on partition ratios of ginkgolide and ginkgolic acid

在不同乙醇体积分数下,银杏黄酮全部分配在下相。由图3可知,乙醇体积分数对银杏内酯的分配也有一定的影响,乙醇体积分数越高,分配比越低,表明在乙醇含量较低时银杏内酯在下相的分配比越高。乙醇体积分数对银杏酸的影响较为复杂,在纯水、乙醇体积分数为60%和80%时,分配比较高,而在乙醇体积分数为40%时,分配比最低,表明在该乙醇浓度下最适合脱除银杏酸。

水相pH值为2,乙醇体积分数为40%时,分别以正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯为有机相,银杏叶提取物中各物质的上下相分配比如图4所示。

从图4可知,以正己烷为有机相时,银杏黄酮、银杏内酯都集中在水相,银杏酸则分配在有机相,表明正己烷为有机相时,脱除效果更好。然而用其他有机溶剂为有机相时,银杏黄酮在两相均有分布。二氯甲烷或三氯甲烷为有机相时,银杏内酯分配比较高,表明银杏内酯也基本分配在水相。从脱酸效果来看,正己烷和二氯甲烷的脱酸效果较好,但是二氯甲烷脱酸时银杏黄酮也有损耗,综上所述,正己烷为最适脱酸溶剂。

图4 有机相成分对银杏黄酮、银杏内酯和银杏酸分配比的影响
Fig.4 Effects of organic phase composition on partition ratios of ginkgo flavone, ginkgolide and ginkgolic acid

本文研究了脱除银杏酸的最佳萃取体系,结果表明:当下相为pH值2.0、体积分数40%乙醇,上相为正己烷时,脱酸效果最好。若结合树脂吸附等脱酸技术,则有望进一步降低提取物中银杏酸含量。